软下疳的发病机理研究进展

软下疳的发病机理研究进展

　　国外医学皮肤性病学分册2000年第26卷第1期

中国医学科学院　　　　　　　　　　　　　　　刘爱英（综述)

　　皮肤病研究所　　　　　　中国协和医科大学　　　　　　　　　　尹跃平　王千秋（审校）

　　 摘　要　软下疳是一种通过性接触传播的生殖器溃疡性疾病。是人类免疫缺陷病毒感染和传播的高危因素之一。其病原体是杜克雷嗜血杆菌。现就该病的发病机理进行综述。

　　 关键词：软下疳　致病机理

　　软下疳是由杜克雷嗜血杆菌（HD）引起的一种性传播性生殖器溃疡性疾病。主要特征表现为生殖器部位的一个或多个疼痛性溃疡，半数以上患者合并腹股沟淋巴结肿大。此病是东南亚、非洲、印度的地方流行病^[1]。有资料表明，软下疳患者感染HIV的危险性是正常人的3～4.7倍^[2]。但至今有关软下疳的发病机理尚不清楚，为了有效地预防和控制本病，从而进一步预防与控制HIV感染及传播，近年来研究软下疳的发病机制受到高度重视。

　　一、杜克雷嗜血杆菌的生化特性

　　1889年Ducrey首先发现软下疳的病原体。1900年，有人对此病原体命名为杜克雷嗜血杆菌。该菌为革兰阴性菌，无荚膜、无鞭毛、无芽胞、无运动力。电子显微镜观察此菌的细胞壁可见一层皱褶外膜包绕细胞浆膜，二层之间为高电子密度的物质即肽糖。HD在感染过程中，可产生与软下疳发病有关的多种毒性因子^[1]。目前已证实的毒性因子包括：依靠接触起作用的细胞毒素即溶血素、细胞外膜的脂寡糖、血红蛋白结合的外膜蛋白、热休克蛋白、一种类似血凝集素的丝状蛋白质、一种新发现的菌毛、铜锌超氧化物岐化酶、直接或间接调节HD毒性因子表达的基因产物等。

　　二、与致病机理相关的杜克雷嗜血杆菌毒性因子及其实验研究

　　（一）溶血素：许多研究表明HD产生一种或多种溶血素。Deacon等报告一种溶解人血凝集块而不溶解兔血的溶血素。Sotten等发现，在兔血琼脂平皿中产生α-溶血的溶血素。Lee等研究HD能产生对绵羊和马红细胞有β-溶血作用的溶血素。Totten等报告一种溶解马、人、牛、绵羊红细胞的溶血素。然而，对这些溶血素尚无详细的研究^[3]。最近，通过血琼脂平皿实验研究HD溶血素的特性，证实HD产生一种具有溶血活性的溶血素，其在对数生长期产生，而不产生于静止期。Totten等进一步研究发现，HD溶血素基因是奇异变形杆菌不依赖钙的溶血素基因即hmpA、hmpB的同源物。hmpA是溶血素结构基因，编码溶血素，而hmpB编码一种分泌蛋白质^[4]。Alfa等证实了上述结论，并发现相当于hmpA、hmpB的两个基因分别为hhdA、hhdB^[5]。HD溶血素对蛋白酶敏感，属于穿孔素家族。除对红细胞有溶解作用外，对其它多种真核细胞有细胞毒作用^[4,5]。又有研究发现，软下疳损害处可见坏死组织，炎症细胞浸润及活的HD持续存在^[3,5]。而HD持续存在需要血红素，体内血红素来源靠溶解宿主细胞而产生^[6,7]。这些现象表明，软下疳损害处存在一种破坏表皮细胞、可诱发炎症反应、促使微生物持续生存的物质即溶血素^[4]。另外，Alfa等及Jotten等^[5]的研究均证实HD能产生溶血素，并且在软下疳发病机制中起重要作用。至于它对别的细胞类型如T细胞、中性粒细胞和巨噬细胞的作用是否在生殖器损害形成中有确切的意义尚需进一步研究^[5]。

　　（二）脂寡糖：脂寡糖是革兰阴性细菌细胞外膜的主要成分，由脂质A、核心寡糖和O抗原糖类侧链组成。由3种成分组成的脂寡糖称为光滑脂寡糖。缺乏O抗原糖类侧链的称为粗糙脂寡糖、Compagnari等^[8]用纯化的HD脂寡糖在小鼠真皮内接种，接种后的反应与整个细菌接种的结果一致。依次出现炎症反应、皮肤破坏、严重的溃疡形成。同时观察到损害组织学变化：炎症性渗出物主要分布于皮下脂肪和肌肉层，有时甚至扩展至真皮层。通过单克隆抗体3F₁₁和6B₄发现绝大多数HD表达脂寡糖表位，该表位与人类Ⅰ和i红细胞抗原相似。这些脂寡糖表位的表达可能是细菌侵害宿主免疫反应的一种机制。因此脂寡糖在软下疳发病机制中，可能是通过使微生物逃避宿主防御，同时吸引炎症细胞致皮肤坏死而发挥作用。Totten等^[4]研究发现脂寡糖可能促进炎症细胞向损害处移动和增强HD被吞噬细胞溶解的抵抗力。为了更深入地了解脂寡糖在软下疳发病机制中的作用，Gibson等^[2]构建HD脂寡糖生物合成途径中的特征性突变菌株。Tn916突变株产生一种缺乏DD-庚糖和远侧端糖基的脂寡糖。这种脂寡糖突变株在体外研究中粘附角质形成细胞的能力明显下降，直接表明HD脂寡糖的末端寡糖是粘附人角质形成细胞的重要配体。角质形成细胞可能是细菌感染早期最先接触到的细胞。Bauer等^[9]用DNA印迹分析发现gmhA基因在HD中很保守，编码HD脂寡糖表达所必需的磷酸庚糖异构酶。通过构建同基因HD gmhA突变株。在温度依赖的兔模型研究中发现，此突变株比野生型对真皮损害明显下降。如将野生型gmhA基因转化于突变菌株可恢复GmhA的表达。同时突变株毒性恢复。这些结果表明，gmhA基因表达产物是HD脂寡糖合成和毒性表达所必需的。Stevens等^[10]研究HD脂寡糖表达，发现LbgA和LbgB的HD中保守的两个基因。它们是脂寡糖表达所必需的。上述从分子水平阐明脂寡糖在软下疳发病机制中的毒性作用。

　　（三）血红蛋白受体：血红蛋白受体（HbgA）位于HD的外膜。是一种表面暴露、保守的蛋白，分子量约100kD。它受血红素调节，血红素水平低的情况下可诱导它起作用，并作为一种受体与血红蛋白结合^[11]。HD的生存必需依赖血红素，自身不能合成，可来源于依赖HD溶血素溶解宿主细胞形成的血红蛋白。HD感染细胞必需克服铁缺乏，铁的可能来源之一是血红素和血红蛋白^[11、12]。因此血红蛋白受体直接影响血红素的来源，间接影响HD铁的来源。从而影响HD的生存和毒性表达。Sturm等^[6]使用一种哺乳动物模型将无致病力的11种菌株置于不同铁化合成物溶液中制成混悬液，然后给兔皮内注射，部分动物模型在注射菌悬液前预先肌注山梨醇化合铁。结果发现所在菌株均产生软下疳溃疡。该结果表明铁剂的获得增强了HD的致病力。Stevens等^[13]在动物模型中对HD毒性表达进行研究时，发现自发形成的血红蛋白结合阴性的突变株失去了表达一种分子量大约100kD的外膜蛋白。并用单克降抗体测定包含编码这种蛋白基因的HD染色体基因片段的一个重组克降。此蛋白命名为利用蛋白A血红蛋白（hupA）。hupA基因核苷酸序列分析表明，它编码蛋白质的分子量为108kD。增加HD培养基中血红素浓度致hupA表达蛋白数量减少。在温度依赖的兔模型中，进行同基因hupA突变株对真皮损害的研究发现其毒力明显低于野生型菌株。Elkins等^[12]研究证实hbgA是编码HbgA的结构基因，用插入或缺失的方法可使克隆的hbgA突变而失去结合血红蛋白的能力或利用血红蛋白作为血红素来源。上述研究表明HbgA是HD生存和毒性表达所必需的，间接地在软下疳发病机制中起作用。

　　（四）热休克蛋白：热休克反应是原核和真核生物适应周围环境应激变化的一种保护性反应。此反应依赖一些热休克蛋白的协同表达。热及其它应激刺激可诱导蛋白产生从而起到保护性作用。热休克蛋白是所有活细胞蛋白的重要组成部分，是生物性复合蛋白，不仅出现在热耐受中，也出现于自身免疫中。有证据表明来自病原微生物的60kD和GroEL同系物是重要的抗原物质，可刺激感染宿主和免疫动物的细胞和体液免疫。Parsons等^[7]鉴定出两种分别编码不同分子量热休克蛋白的GroES和GroEL开放读框。RNA和蛋白分析证实这两种读框在HD增殖和静止期均高水平表达，而且在软下疳患者和接种HD的动物模型中产生免疫反应。用软下疳患者和免疫的鼠、兔血清进行分析结果与上述结论一致^[14]。Parsons等^[15]在研究中将含Dnak（属于热休克蛋白70家族）的多拷贝质粒导入HD中，使GroEL表达下降。交换Dnak和GroEL结果降低了HD在应激条件下生存和粘着，表明Dnak是热休克蛋白的负性调节器。另外，发现当HD在最适培养温度时，GroEL基础水平比相应大肠杆菌高5倍。降低GroEL水平可使HD与人生殖器细胞系的粘着力下降。总之，HD热休克蛋白能增加它适应环境应激变化而生存的能力，也能与宿主细胞相结合，并且刺激宿主细胞和体液免疫反应，直接或间接地在软下疳发病机制中起作用。

　　（五）其它毒性因子：Ward等^[16]发现HD分泌一种类似血凝集素的丝状蛋白质，此蛋白由两个大的开放读框LSPA₁和LSPA₂编码。在温度依赖的动物模型研究中发现无毒性的HD不产生LSPA₁、LSPA₂。该发现表明LSPA₁、LSPA₂可能与HD引起实验性损害有关。同时表明此蛋白与HD和宿主细胞相互作用有关。Brentjens等^[17]发现HD表达一种新型独特的菌毛，分子量为24kD的蛋白质，可能以不依赖信号序列的机制输出，尚待进一步研究它在HD发病机制中的作用。Purven等^[18]研究发现，HD产生另外一种不同于溶血素的细胞毒素是分子量为24kD的单一小蛋白。其在培养的人表皮细胞实验中能引起表皮细胞死亡，并且在大多数软下疳患者血清中可检测到此细胞毒素的中和抗体。据San mateo等^[19]研究，Cu-Zn超氧化物歧化酶存在于HD感染的整个细胞溶解产物中。构建此酶缺陷的HD突变株比野生型更易被细胞外超氧化物杀死。此结果表明，在感染期间此酶可能在细菌保护自身免遭宿主免疫细胞氧化杀死中起一定作用。

　　三、展望

　　目前对HE产生的毒性因子在软下疳发病机制中作用的实验研究已深入到分子生物学水平。尤其是同基因突变株的构建以及毒性因子机关基因的研究，为深入了解HD的发病机制提供了有效手段，并且为设计预防软下疳的疫苗以及对降低HIV感染的危险性将发挥重要作用。

　　参考文献

　　1 Abeck D et al. Acta Veneveol,1991;174:5-20

　　2 Gibson BW et al. J Bacteriol,1997;179:5062-5071

　　3 Palmer KL et al. Infect Immun.1994;62:3041-3043

　　4 Toten PA et al. Infect Immun,1995;63:4409-4416

　　5 Alfa MJ et al. Infect Immun,1996;64:2349-2352

　　6 Sturm AW.Sex Transm Dis,1997;24:64-68

　　7 Parsons LM et al. Infect Immun,1992;60:4111-4118

　　8 Campagnari AA et al. Infect Immun,1991;59:2601-2608

　　9 Bauer BA et al. Infect Immun,1991;59:2601-2608

　　10 Stevens MK et al. Infect Immun,1997;65:651-660

　　11 Elkins C et al. Infect Immun,1995;63:1241-1245

　　12 Elkins C et al. Infect Immun,1995;63:2194-2200

　　13 Stevens MK et al. Infect Immun,1996;64:1724-1735

　　14 Frisk A et al. Infect Immun,1998;66:1252-1257

　　15 Parsons LM et al. Infect Immun, 1997;65:2413-2419

　　16 Ward CK et al. J Bacteriol,1998;180:6013-6022

　　17 Brentjens KJ et al. J Bacteriol,1996;178:808-816

　　18 Purven M et al. Infect Immun,1997;65:3496-3499

　　19 San Mateo LR et al.Mol Microbiol,1998;27:391-404

（编辑：小徐 ）