cDNA代表性差异分析法的建立及克隆银屑病相关基因片段初探
cDNA代表性差异分析法的建立及克隆银屑病相关基因片段初探
中华皮肤科杂志 2000年第2期第33卷 论著
作者：陶苏江 范青源 方跃明 谢毅 应康 牟贤龙 顾军 郑茂荣
单位：陶苏江（200433上海，第二军医大学附属长海医院皮肤科）；范青源 方跃明 牟贤龙 顾军 郑茂荣（200433上海，第二军医大学附属长海医院皮肤科）；谢毅 应康（复旦大学遗传工程国家重点实验室）
关键词：银屑病聚合酶链反应核酸杂交
【摘要】目的 通过cDNA代表性差异分析法（cDNA－representationaldifferenceanalysis，RDA）来寻找银屑病皮损组织中特异表达的基因片段。方法 用改良的异硫氰酸胍一步法提取银屑病皮损及正常皮肤组织的tRNA及mRNA，逆转录后采用差减杂交及选择性PCR扩增相结合为基础的RDA方法，使含有特定接头的银屑病组cDNA片段得到大量扩增。结果 通过质量分数1％琼脂糖凝胶电泳及放射自显影分析，两组皮肤组织mRNA质量及丰度都比较高；经过两次PCR扩增后在琼脂糖凝胶电泳上可见5条清晰条带，其大小范围在100～600bp之间。结论 本实验表明银屑病皮损组织中可能存在与正常皮肤组织差异表达的基因；cDNA－RDA方法对于识别差异表达的基因具有高效性。
Cloning of Psoriasis－ associated Genes by Representational Difference Analysis of cDNA
TAO Sujiang， FAN Qinyuan， FANG Yueming，et al.
（Department of Dermatology, Changhai Hospital, Second Military Medical University, Shanghai 200433）
【 Abstract】 Objective To identify the specifically expressed genes in psoriatic lesions by cDNA representational difference analysis（ cDNA－ RDA） . Methods The total RNA from psoriatic lesions and normal skin was extracted with modified single step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate phenol chloroform extraction. mRNA was converted to cDNA. Then cDNA－ RDA was employed with a PCR coupled subtractive approach. Only psoriatic cDNA which contained appropriate adaptors could be amplified. Results The high quality and abundance of mRNA from both lesions and normal skin were demonstrated by 1％ agarose gel electrophoresis and autoradiography.After double amplification,the PCR products showed 5 distinctive bands on 1％ agarose gel ranged from 100 to 600 bp. Conclusions Our experiment demonstrates that differentially expressed genes might present in psoriatic lesions in comparison with that in normal skin. cDNA－ RDA is a highly efficient method for identification of such differentially expressed genes.
【Key words】Psoriasis Polymerase chain reaction Subtractive hybridization
银屑病是一种常见的炎症性皮肤病。流行病学调查及遗传学研究表明银屑病是多基因遗传性疾病[1]。目前已发现多个银屑病易感基因[2,3]，如果能寻找银屑病特异基因，将可能对银屑病发病机理的研究及临床治疗带来新的突破，包括建立银屑病动物模型及进行基因治疗[4]等。我们通过cDNA代表性差异分析法（cDNA－representationaldifferentialanalysis,cDNA－RDA）[5]，通过差减杂交和选择性扩增来寻找银屑病差异表达基因，为进一步从基因水平探讨银屑病的发病机理及临床治疗提供新的基础。
材料和方法
（一）标本：取寻常型斑块状银屑病皮损组织及正常人皮肤组织各约1g。阳性对照组骨骼肌mRNA由PCR－SelectcDNASubtraction试剂盒提供。
（二）试剂及仪器：
1.主要试剂：异硫氰酸胍（Serva公司）；十二烷基肌氨酸钠（购自华美生物工程公司，Sigma分装）；[α－32P]dCTP（北京亚辉生物工程公司）；TaqDNA聚合酶（复旦大学遗传研究所）；OligotexmRNAMini试剂盒（Qiagen公司）；SuperscriptTMⅡRNaseH－逆转录酶试剂盒（Gibco公司）；PCR－SelectcDNASubtraction试剂盒（Clontech公司）；其它均为国产分析纯试剂。
2.主要仪器：GeneAmp9600＆2400PCR仪（美国Perkin－Elmer公司）；高速冷冻离心机（日立）；ModelCDS－200扫描仪（BeckmanUSA）；TGL－16G台式高速离心机（日本）；手提式同位素检测仪（上海医疗器械五厂）；核酸水平电泳仪（上海精益有机玻璃制品仪器厂）；UV－240紫外分光光度计（日本岛津公司产）。
（三）引物均由Clontech试剂盒提供：cDNA合成引物：5′－TTTTGTACAAGCTT30－3′。接头1：5′－CTAATACGACTCACTATAGGGCTCGAGCGGCCGCCCGGGCAGGT－3′，3′－GGCCCGTCCA－5′。接头2R：5′－CTAATACGACTCACTATAGGGCAGCGTGGTCGCGGCCGAGGT－3′，3′－GCCGGCTCCA－
5′。PCR引物1的设计为接头1或接头2R的前22个碱基:5′－CTAATACGACTCACTATAGGGC－
3′。Nested引物1为接头1的末22个碱基：5′－TCGAGCGGCCGCCCGGGCAGGT－3′。Nested引物2R
为接头2的末20个碱基：5′－AGCGTGGTCGCGGCCGAGGT－3′。
（四）主要技术过程：总RNA抽提及mRNA纯化→cDNA双链合成→双链cDNA酶切→银屑病组及阳性对照组酶切后的cDNA两端分别加接头1及2R（用作tester）→两轮杂交反应→两轮PCR扩增。
1.采用异硫氰酸胍一步法加以改进进行两组皮肤组织总RNA抽提，详见文献[6]。mRNA纯化采用OligotexmRNAMini试剂盒（详细操作见说明书）。对得到的mRNA用放射自显影法进行纯度检测，用紫外分光光度计进行定量。
2.cDNA双链合成：第一链合成反应液：两种皮肤组织mRNA4μL，cDNA合成引物(10μmol/L)1μL，5×第一链缓冲液2μL，dNTP（10mmol/L）1μL，[α－32P]dCTP1μL，AMV逆转录酶（20U/μL）1μL，空气浴42℃1.5h。第二链合成反应液：5×第二链缓冲液16.0μL，dNTP(10mmol/L)1.6μL，20×第二链酶混合液4.0μL，终体积70μL。16℃放置2h。加2μLT4DNA聚合酶，混匀，16℃放置30min。阳性对照组骨骼肌mRNA操作同上进行。
3.双链cDNA酶切：反应体系：两组皮肤组织及骨骼肌dscDNA43.5μL，10×RsaⅠ缓冲液5.0μL，RsaⅠ酶(10U/μL)1.5μL，37℃1.5h。酶切后的正常皮肤组织cDNA用作实验组驱动子，骨骼肌cDNA用作阳性对照组驱动子。
4.银屑病组酶切后的cDNA两端分别加接头1及2R（用作测试子）：反应体系：银屑病组cDNA2μL，接头1（10μmol/L）及接头2R（10μmol/L）2μL，5×连接液2μL，T4DNA连接酶（400U）1μL，终体积10μL，16℃过夜。阳性对照组的测试子的准备则是骨骼肌cDNA加入稀释的ΦX174DNA/HaeⅢ混匀后按上述过程操作。
5.两轮差减杂交反应：第一轮杂交反应体系：连接头1、接头2R的银屑病组cDNA（测试子）各1.5μL，RsaⅠ酶切的正常皮肤组cDNA（驱动子）1.5μL，4×杂交缓冲液1.0μL，终体积为4.0μL，98℃1.5min，68℃8h。第二轮杂交反应液：正常皮肤组cDNA1μL，4×杂交液1μL，无菌水2μL，混匀后取1μL，98℃1.5min。再与第一轮杂交液反应，68℃过夜。阳性对照组操作同上。
6.两轮PCR扩增：第一轮扩增体系：上述杂交液1μL，10×PCR反应缓冲液2.5μL，dNTP混合液(10mmol/L)0.5μL，PCR引物1(10μmol/L)1.0μL，50×聚合酶混合液0.5μL，无菌水19.5μL，终体积25.0μL。PCR反应条件：75℃，5min；94℃，25s；然后按下面参数进行30个循环：94℃，10s；64℃，30s；71℃，1.5min。取上述PCR反应液3μL稀释于27μL水中，再从其中取出1μL作为模板进行第二轮PCR扩增，其体系：模板1μL，无菌水18.5μL，10×PCR反应缓冲液2.5μL，dNTP混合液（10mmol/L）0.5μL，NestedPCR引物1(10μmol/L)1.0μL，NestedPCR引物2R(10μmol/L)1.0μL，50×聚合酶混合液0.5μL，终体积25.0μL。PCR反应条件：按下面参数进行12个循环：94℃，10s；68℃，30s；72℃，1.5min。反应产物－20℃保存。阳性对照组操作同上。
结果
（一）用紫外分光光度计检测，银屑病皮损组织tRNA的A260/A280比值为2.06，正常人皮肤组织为2.02，两者样品比值均大于1.8，提示样品的纯度较高，无明显蛋白质污染。根据A260值，可计算出每毫克人体皮肤组织能提取tRNA约0.4μg左右。质量分数1.2％琼脂糖电泳（图1）检测除见到清晰的28S及18S条带外（说明没有降解），在18S前还可见到一条带，该带未曾在其它组织中见到，可能系皮肤组织特有。
1、2、3、4泳道分别显肝、肾、银屑病及正常皮肤组织
1 总RNA电泳
（二）阳性对照组未差减骨骼肌经第二轮PCR扩增后得到的条带（图2）为弥散条带（泳道3）；而经差减杂交后，测试子中与驱动子相同的骨骼肌cDNA被去除，未得到扩增，测试子中只有差异的ΦX174DNA/HaeⅢ酶切的DNA条带得到扩增（泳道4），它与标准参照物的带形完全一致，说明本实验的阳性对照组得到预期的结果。实验组未差减及差减后cDNA第一轮PCR产物呈现为弥散条带，背景较亮；第二轮PCR产物中差减前cDNA则为弥散条带（泳道1），差减后则可见到5条清晰条带（泳道2）。说明经差减杂交后，测试子及驱动子中相同的序列未扩增，只有差异的cDNA条带得到扩增。
1：银屑病组未差碱cDNA 的PCR扩增产物；2：银屑病组差减后cDNA的第二轮PCR 产物；3：对照组骨肌未差减cDNA的PCR扩增产物；4：对照组骨骼肌差减后cDNA的PCR扩增产物；M：ΦX174DNA/HaeⅢ酶切的标准参照物
2 银屑病组差减cDNA的PCR扩增结果
讨论
目前寻找两种组织或细胞中差异表达基因的方法主要有差异显示PCR（differential display PCR,DDPCR）技术[7]和基因代表性差异分析技术[5,8]。前者的主要原理用随机引物对两种组织/细胞的全部mRNA进行逆转录并扩增，再通过测序凝胶电泳分析来比较并寻找差异表达的基因。该方法的应用有较多的局限性，如实验成本高、流程长、操作复杂、需应用大量的同位素，且假阳性克隆多；另外分离出的差异片段位于基因的3′未翻译区，不利于进一步寻找完整读框的基因[9]。cDNA－RDA[5]则可克服这些缺点，其基本原理为把两组mRNA逆转录为cDNA，其中含特异（不同表达）基因组称为“测试子”，另一不含该基因的参照组称为“驱动子”。测试子和过量的驱动子cDNA进行差减杂交，差异表达基因得以富集。同时，用选择性PCR扩增方法对两组杂交的相同序列不予扩增，而只对未杂交的片段进行选择性大量扩增，得到的就是差异表达的cDNA片段，大大减少了候选基因的数目，使该方法具有快速、简便、特异性高等优点。用该方法仅需0.5～2μg的mRNA，而通常的差减杂交方法需20μg的mRNA，这样极大地方便了材料的准备，尤其对含mRNA极少的皮肤组织更有其优越性。此外，它不需对单链和双链分子进行机械分离，方便了实验操作。
本实验中银屑病皮损组织和正常人皮肤组织分别来自6例不同个体（共约1g），把各组皮肤组织分别混合在一起进行总RNA抽提，可以避免因个体之间的mRNA表达差异而造成的差异条带的非特异性，使实验更能集中研究两组组间的共同差别，得到的结果能更好地代表与银屑病相关的致病基因；病例数越多，则通过差减杂交个体差异表达的基因越可能被去除，所获得的差异表达基因越可能代表真正的银屑病致病基因。当然，如果能选择一组有银屑病家族史的病例进行分析将更有意义。
本实验以银屑病组cDNA为测试子，以正常皮肤组织为驱动子，得到银屑病组织中高表达的基因片段。反过来，若以银屑病组cDNA为驱动子，以正常皮肤组织cDNA为测试子，将得到正常皮肤组织中相对高表达的基因片段，这将对探讨银屑病的发病机理提供进一步的理论依据。
参 考 文 献
1，Henseler T. The genetics of psoriasis. J Am Acad Dermatol, 1997, 37:S1－ S11.
2，Tomfohrde J, Silverman A, Barnes R, et al. Gene for familial psoriasis susceptibility mapped to the distal end of human chromosome 17q. Science, 1994, 264: 1141－ 1145.
3，Bowcock AM. Genetic locus for psoriasis identified. Ann Med, 1995, 27: 183－ 186.
4，Elder JT, Nair RP, Sun WG. The genetics of psoriasis. Arch Dermatol, 1994, 130:216－ 224.
5，Hubank M, Schatz DG. Identifying differences in mRNA expression by representational difference analysis of cDNA. Nucleic Acids Res, 1994, 22: 5640－ 5648.
6，Chomczynski P, Sacchi N. Single step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate phenol chloroform extraction. Anal Biochem, 1987, 162:156－ 159.
7，Liang P,Pardee AB. Differential display of eukaryotic messenger RNA by means of the polymerase chain reaction. Science, 1992, 257: 967.
8，Lisitsyn N, Lisitsyn N, Wigler M. Cloning the differences between two complex genomes. Science, 1993, 259: 946－ 951.
9，Braun BS, Frieden R, Lesnick SL, et al. Identification of target genes for the Ewing′ s sarcoma EWS/FLI fusion protein by representational difference analysis. Mol Cell Biol, 1995, 15: 4623－ 4630.
收稿日期：1999－03－05
（编辑：艾美丽）
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