雷公藤内酯醇对体外培养的成骨细胞增殖的影响

来源：华人健康网 | 发布时间：2011-09-30 13:28:21 | www.chinesejk.com

中华皮肤科杂志 2000年第2期第33卷论著

作者：黄岚　冯树芳　王洪复　金慰芳　魏道林　高建军

单位：黄岚　冯树芳（200040　上海医科大学华山医院皮肤科）；王洪复　金慰芳　魏道林　高建军（上海医科大学放射医学研究所）

关键词：雷公藤内酯；成骨细胞

　　【摘要】目的　观察雷公藤内酯醇（TL）对体外培养成骨细胞增殖的影响，以进一步探讨雷公藤致女性骨质疏松的机制。方法　以SpragueDauley(SD)大鼠成骨细胞增殖为模型，分离新生SD大鼠头盖骨成骨细胞，传代后加入不同浓度TL。每浓度组设4个复孔，以PBS作阴性对照，用MTT比色分析法检测TL在体外对成骨细胞增殖的作用和效价。结果　培养2d，10ng/mLTL显著抑制成骨细胞增殖(P＜0.01)；培养4d，0.01ng/mLTL显著抑制成骨细胞增殖(P＜0.01)。药物对成骨细胞增殖的抑制程度与其剂量呈正相关(P＜0.05)。结论　TL微量时即显著抑制成骨细胞增殖，且呈剂量依赖性。雷公藤对成骨细胞的直接抑制作用是其导致药物性骨质疏松的一个重要原因。

Effects of Triptolide on the Proliferation Capacity of Osteoblasts in vitro

HUANG Lan, FENG Shufang, WANG Hongfu,et al.

　　（Department of Dermatology, Huashan Hospital, Shanghai Medical University， Shanghai 200040）

　　【 Abstract】 Objective The effects of Triptolide（ TL） on the proliferation capacity of osteoblasts were studied in order to further explore the mechanism of osteoporosis induced by Tripterygium Wilfordii Hook.F (TW). Methods Osteoblasts were obtained from the calvaria of new born SD rats and were cultured with various concentrations of TL. The effects of TL on proliferation capacity of osteoblasts were detected by MTT methods. Results The proliferation rates of osteoblasts cultured for 2 days and 4 days were significantly inhibited by 10 ng/mL and 0.01 ng/mL of TL respectively. The inhibition rate was positively correlated with TL concentrations. Conclusion It is indicated that the direct suppressive effects of TL on proliferation capacity of osteoblasts play an important role in the pathogenesis of osteoporosis induced by TW.

　　【 Key words】Triptolide Osteoblast

　　雷公藤因其具有抗炎、免疫抑制、抗肿瘤及调节环核苷酸代谢等作用而广泛应用于临床。我们曾经观察到，长期服用雷公藤有致女性SLE患者骨质疏松的副作用，使其腰椎骨密度显著下降^[1]。本实验以大鼠体外培养成骨细胞增殖为模型，选用雷公藤活性单体雷公藤内酯醇（triptolide,TL），用MTT比色分析法检测该药活性单体TL在体外对成骨细胞的作用和效价，在细胞水平上进一步探讨雷公藤致女性骨质疏松的机制。

　　材料和方法

　　一、材料

　　1.动物：新生雌性Sprague－Dauley(SD)大鼠，放射医学研究所动物房提供。沪医实验动物合格证：34。

　　2.药物和试剂：①TL：由中国医学科学院皮肤病研究所郑家润教授提供，以二甲基亚砜(DMSO)助溶，磷酸缓冲液(PBS)按10倍稀释。②试剂：E－MEM培养液、体积分数为10％小牛血清(NCS)EMEM培养液、PBS、0.25％胰蛋白酶溶液、0.1％Ⅱ型胶原蛋白酶溶液、5mg/mL塞唑蓝(MTT,Fluka产品)、10％十二烷基硫酸钠(SDS)等。

　　3.仪器：超净工作台、冷冻离心机、恒温水浴槽、光学显微镜、倒置相差显微镜、CO₂培养箱、可见分光光度计、微量可调式加样器、12及24孔培养板。

　　二、方法

　　1.成骨细胞分离：参阅文献^[2]。新生雌性SD大鼠，16.3mol/L(75％)酒精浸泡消毒15min，去头皮取头盖骨，剔除血管及粘附的结缔组织，PBS清洗3次后剪成小块，用0.25％胰蛋白酶预消化20min，0.1％Ⅱ型胶原酶消化2次，每次于37℃振荡60次/min消化1h。消化液于1000r/min离心10min，沉淀物即为成骨细胞，经PBS洗后，加10％NCS－EMEM培养液吹打，制成细胞悬液，接种培养瓶培养。第2天换液，以后每隔2～3d换液1次。经5～6d培养，成骨细胞生长至融合，用0.25％胰蛋白酶消化，加10％NCS－EMEM培养液吹打，制成细胞悬液，血球计数板计数后即可作传代培养。

　　2.成骨细胞培养：成骨细胞以1×10⁴个/孔传入24孔板，第2天换液时每孔加培养液1.9mL,及不同浓度的TL药液100μL,使TL终浓度为10－4～10⁴ng/mL，所含溶媒DMSO最高终体积分数为0.1％。对照组培养液中含0.1％DMSO。每浓度组均设4个复孔。在37℃、体积分数5％CO₂中分别培养2d和4d。

　　3.MTT孵育及测定^[3]：细胞于培养结束前经PBS洗后，加入无血清EMEM培养液1.0mL及5mg/mLMTT50μL,培养4h。培养结束后加入10％SDS溶液1.0mL，于723型分光光度计570nm处比色测定，以无血清EMEM培养液1.0mL、5mg/mLMTT50μL及10％SDS溶液1.0mL为空白调零。结果以A值表示，计算成骨细胞细胞增殖抑制率(inhibitionrate,IR)。

　　4.统计学处理：所得结果以±s(n=4)表示，进行两样本均数的t检验，方差不齐时为t′检验。药物剂量与效应的相关分析：以成骨细胞增殖抑制率对药物浓度的对数值作药物量效的相关分析。

　　结果

　　一、溶媒DMSO浓度的确定

表1 不同浓度DMSO对成骨细胞增殖的影响(±s,A值)

DMSO的体积分数(％)	培养2 d	培养4 d
0	0.1150±0.0447	0.2410±0.0228
0.1	0.1123±0.0519	0.2298±0.0239
0.25	0.1375±0.0694	0.1610±0.0113^＊
0.5	0.1350±0.0268	0.1465±0.0065^＊
1.0	0.1250±0.0203	0.1380±0.0212^＊
2.0	0.0753±0.0240	0.0648±0.0078^＊

　　＊与阴性对照组比较P＜0.01,n=4

表2　不同质量浓度雷公藤内酯醇对成骨细胞增殖的影响(n=4)

雷公藤内酯醇质量浓度(ng/mL)	培养2d		培养4d
	A值(±s)	IR(％)	A值(±s)	IR(％)
0	0.1683±0.0186		0.3613±0.0088
10－4	0.1570±0.0231	6.7	0.3503±0.0167	3.0
10－3	0.1478±0.0095	12.2	0.3425±0.0246	5.2
10－2	0.1393±0.0264	17.2	0.3280±0.0132^＊	9.2
10－1	0.1525±0.0222	9.4	0.2905±0.0093^＊	19.6
1	0.1523±0.0154	9.5	0.2650±0.0260^＊	26.6
101	0.1113±0.0221^＊	33.9	0.1620±0.0085^＊	55.2
102	0.0405±0.0111^＊	75.9	0.0458±0.0127^＊	87.3
103	0.0328±0.0205^＊	80.5	0.0465±0.0091^＊	87.1
104	0.0270±0.0101^＊	84.0	0.0430±0.0076^＊	88.1

　　与阴性对照组比较，＊P＜0.01　　结果显示：培养液内含体积分数为0.1％DMSO对成骨细胞增殖无影响(见表1)。

　　二、TL对体外培养成骨细胞增殖的影响

　　培养2d及4d，TL对成骨细胞增殖有显著抑制作用，起效质量浓度分别为10ng/mL、10^－2ng/mL（见表2）。且随着药物质量浓度的提高，对成骨细胞增殖的抑制程度相应增加。以成骨细胞增殖抑制率对药物质量浓度的对数值作药物量效的相关回归分析，可见两者间存在着线性关系：培养2d，y=4.7483Ln（x）＋36.589，r=0.889，P＜0.01；培养4d，y=5.6306Ln（x）＋42.367，r=0.954，P＜0.01(x为药物质量浓度，y为成骨细胞增殖抑制率)。

　　讨论

　　临床研究表明，长期应用雷公藤可致女性骨质疏松，机制与其抑制性腺、降低雌激素水平使破骨活动增强有关^[1]。此外，成骨细胞是骨形成细胞，对骨组织的生长发育、损伤修复、骨代谢平衡和骨量维持起关键作用。一旦成骨细胞衰老，其生成不足和功能降低，也将直接导致骨形成减少，不能及时补充由于破骨细胞活动所导致的骨吸收、骨量丢失，引起骨质疏松症的发生。本研究以体外培养成骨细胞增殖和功能表达为模型，在细胞水平上进一步探讨雷公藤致骨质疏松的机制。

　　本文采用成骨细胞分离培养技术（酶消化法和骨内成骨细胞培养法）原代分离培养成骨细胞，具有细胞分离量多，易于满足实验要求，分离纯度高，可减少成纤维细胞污染等优点。分离培养的细胞贴壁生长，形态呈三角形、多角形、立方形，碱性磷酸酶染色阳性，具有一定的钙转换能力，符合成骨细胞形态及功能特点^[2]，证实为成骨细胞。成骨细胞数量和功能状况直接影响骨形成能力。Marie对特发性骨质疏松患者的研究发现，其成骨细胞DNA合成能力下降^[4]。本文采用简便、迅速、准确、价廉的MTT比色分析法测定成骨细胞的细胞增殖率^[3]，能准确、灵敏地反映药物对成骨细胞存活和增殖的影响，进而反映药物对骨形成能力的影响。本研究结果表明，培养2d10ng/mLTL显著抑制成骨细胞(P＜0.01)，培养4d0.01ng/mLTL显著抑制成骨细胞增殖(P＜0.01)，进一步证实雷公藤所致的药物性骨质疏松与其显著抑制成骨细胞增殖有关。TL是从雷公藤中提取出的一种活性环氧二萜内酯化合物单体，兼具明确的抗炎、免疫抑制及抗生育作用，被认为是治疗类风湿性关节炎等疾病的主要有效单体成分。郑家润等的研究则表明，TL与雷公藤的其它活性化学成分一样，其免疫抑制作用与性腺抑制抗生育作用不可分离^[5]。国内张修罗^[6]、蒲丽霞^[7]分别报道，TL10^－2μg/mL、5×10^－3μg/mL在体外能显著抑制ConA诱导的小鼠脾细胞增殖，5×10^－2μg/mL能抑制LPS诱导的小鼠脾细胞增殖。而本研究则表明在此浓度时TL已能显著抑制成骨细胞的增殖。根据TL的大鼠药代动力学研究结果换算，口服或静脉注射1次TL血药浓度可达10～10²ng/mL，而TL体内消除缓慢，其消除半衰期长达58～59h，有一定的蓄积作用^[8]。因此推测长期服用雷公藤时，体内蓄积的药物浓度足可抑制成骨细胞增殖，甚至进一步抑制其功能的表达，造成骨质疏松。本研究结果也表明，TL对成骨细胞增殖的抑制呈剂量依赖性。随着药物浓度的提高，其对成骨细胞的抑制作用逐渐增加，统计学检验两者密切相关(P均＜0.01)。提示对于长期服药的患者，应注意监测其血药浓度，以防止药物体内蓄积，造成对骨骼系统不可逆的损伤。

　　参考文献

　　1，黄岚，冯树芳，王洪复.系统性红斑狼疮患者长期服用雷公藤对骨密度的远期影响．中华皮肤科杂志，1998，31：2－3.

　　2，王洪复，关本博，林光义.由胎鼠头盖骨培养骨细胞的实验技术和细胞形态观察．上海医科大学学报，1991,18:475－477.

　　3，Mosmann T. Rapid colormetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays. J Immunol Methods， 1983,65:55－ 63.

　　4，Marie PJ, Vernejoul MC, Connes D， et al. Decreased DNA synthesis by cultured osteoblastic cells in eugonadal osteoporotic men with defection bone formation. J Clin Invest， 1991,88:1167－ 1172.

　　5，郑家润,顾克显,高纪伟，等.雷公藤抗炎免疫及抗生育活性成分的筛选Ⅳ：七个环氧二萜内酯化合物体内雄性抗生育活性的比较.中国医学科学院学报，1991,13:398－403.

　　6，张罗修.雷公藤红素对小鼠淋巴细胞增生的抑制作用．中国药理学报，1986,7:85.

　　7，蒲丽霞.雷公藤内酯对T淋巴细胞功能的影响．中国药理学报，1990,11:76.

　　8，凌树森，张敏，石晶，等.雷公藤甲素的动力学研究.中药药理与临床，1991,7:21－24.

收稿日期：1999－04－22

（编辑：艾美丽）

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