正常老年人与阿尔茨海默病脑内生长抑素神经元分布及其与细胞凋亡的关系
正常老年人与阿尔茨海默病脑内生长抑素神经元分布及其与细胞凋亡的关系
中国神经精神疾病杂志 1999年第1期第0卷 论著与学术交流
作者：张晨辉* 李卫平△
单位：* 原第一军医大学附属南方医院神经内科进修医师 现在广州市老人院(510550)；△ 第一军医大学附属南方医院神经内科
关键词： 生长抑素；细胞凋亡；老年；阿尔茨海默病；大脑皮层
【摘要】 目的 探讨正常老年人与阿尔茨海默病(Alzheimers disease, AD)患者不同区域大脑皮层中生长抑素(Somatostatin, SOM)阳性神经元数量是否存在差异，以及这些神经元是否以细胞凋亡的方式死亡或消失。方法 采用免疫组织化学方法观察SOM阳性神经元；采用TUNEL法观察细胞凋亡。结果 正常老年人及AD病人大脑皮层不同区域内的SOM阳性神经元的数量未见显著性差异，但可见细胞凋亡。而SOM阳性神经元与TUNEL阳性细胞并不完全重叠出现。结论 正常老年人及AD病人大脑皮层内SOM阳性神经元均较少，但两者之间无明显差异。细胞凋亡与SOM阳性神经元之间似无明显相关性。
Distribution of somatostatin-positive neurons and the relationship between somatostatin and apoptosis in the brains in normal aging and Alzheimer’s disease. Zhang Chenhui, Li Weiping. Aging People’s Home of Guangzhou City, Zhongluotan Town Baiyun region, Guangzhou. 510550.Tel:020-87811320-815
【Abstracts】 Objective To study whether there were any difference in the distribution and in the number of somatostatin (SOM) positive neurons in several brain regions in the normal aging individuals and in the patients with Alzheimer’s disease (AD) and if there was any relationship between SOM-positive neurons and apoptosis. Methods Immunohistochemistry was used to label SOM-positive neurons and the terminal dUTP end labelling method was employed in the apoptosis study.Results SOM-positive neurons were observed in all the examined brain regions, but no significant difference was found in the number of these neurons between the normal aging and the patients with AD. There was also no significant correlation between SOM-positive and TUNEL-positive cells.Conclusions There were a few SOM positive neurons in the brain cortex both in the aging and AD. The relationship hadnt been found between SOM positive neurons and apoptosis.
【Key words】 Somatostatin Apoptosis Aging Alzheimer’s disease Cortex
有学者提出生长抑素(Somatostatin, SOM)可能与老化，尤其是与阿尔茨海默病(Alzheimers disease, AD)的发生有关。采用放射免疫测定法发现，AD患者脑组织和脑脊液中SOM含量减少［1，2］，提示此类病人脑中SOM神经元的数量可能减少，但SOM神经元减少的机制目前尚不清楚。本研究主要观察正常老年人与AD患者大脑皮层的不同部位内SOM阳性神经元分布是否存在差异，以及SOM阳性神经元与细胞凋亡的关系。
1 资料与方法
1.1 临床资料 11例病人为广州市老人院的住院老人，男3例，女8例，年龄82～96岁，平均84.5岁。生前行长谷川痴呆量表(HDS)、体检及神经系统检查，其中4例HDS得分低于10分，临床表现为痴呆，符合DSM-Ⅲ-R的痴呆诊断标准，其余7例HDS得分正常，体检及神经系统无阳性发现。病理学检查：4例AD患者脑组织额叶皮层及海马等部位，可见较多老年斑(SP)及神经原纤维缠结(NFT)，SP每低倍视野10～56个不等；7例正常老年人脑组织中无特殊发现。所有病例脑剖检时间为死后1.0～18.5h，平均7.2h。剖检后即分别在额叶、海马、枕叶等处皮层取材，以4%多聚甲醛4℃固定，48小时后石蜡包埋，石蜡切片厚10μm,作相邻部位连续切片。
1.2 方法
1.2.1 SOM的免疫组化方法：切片除蜡，经不同浓度乙醇(90%，85%，70%)水化，以0.3%过氧化氢灭活内源性过氧化物酶活性，4℃的恒温下，在1∶200的抗SOM(Sigma,CO)抗体中反应12 h，再以0.01mol的PBS液洗涤，生物素标记的二抗处理1 h，以ABC复合液(ABC Kit, Vector Lab. U.S.A)洗涤，经DAB(20mg/mL)显色，SOM阳性神经元呈现棕色沉淀，阴性对照组一抗用0.01 mol的BPS液代替。
1.2.2 细胞凋亡的TUNEL(termminal deoxynucleotidy1 transfereras-mediated dUTP-biotinnick end labelling)方法：TUNEL法原位标记DNA片断检测细胞凋亡，具体步骤按照Oncor(USA)公司的Apop TagTM过氧化物酶试剂盒操作手册进行，采用DAB显色，棕黄色圆形指环状结构为TUNEL阳性结果。阳性对照采用突变族金鱼的视网膜组织。
1.2.3 免疫荧光显色法：以二甲苯和水清洗切片，经1∶200的兔抗SOM溶液孵育12 h，再用1∶200结合有荧光剂的羊抗兔免疫γ球蛋白溶液作为二抗(peninsula, U.S.A)。阴性组用0.01 mol的PBS液代替一抗。
1.2.4 计数与统计：同一脑区的组织切片，分别经SOM免疫组化反应及TUNEL方法，观察SOM阳性神经元及细胞凋亡，用DAB显色。SOM阳性细胞在400倍光镜下计数，随机选择70个相邻视野，取其平均值。选择部分TUNEL阳性染色的切片，经SOM免疫组化的方法复染，但采用免疫荧光显色法显示SOM阳性细胞，与同一部位的TUNEL阳性细胞比较，观察两者之间的关系。统计指标为均数及标准差，采用t检验进行显著性检验。
2 结果
在正常老年人及AD患者大脑皮层，包括额叶、枕叶以及海马内，均可发现SOM阳性神经元(图1)。在海马结构内，其散在分布于锥体细胞的深层，CA1-CA3区均可见，但齿状回中缺如。额叶、枕叶皮层中SOM阳性神经元数量较少，主要散在分布于锥体细胞的Ⅲ～Ⅴ层，占锥体神经元约10%。在放大400倍光镜下，将正常老年人及AD患者额叶、枕叶及海马等不同区域内每个视野SOM阳性神经元数量的均数进行比较，未见显著性差异(P＞0.05)，见表1。分别观察额叶、枕叶及海马等部位TUNEL阳性细胞与SOM阳性神经元之间的关系，发现两者之间的显现并不完全一致，TUNEL阳性细胞只有部分属于SOM阳性神经元，而相当大部分凋亡细胞并非SOM阳性细胞(见图2)。
Table 1 Comparisions of the amount of SOM-positive nourons
in several brain regioins between AD and control
表1 正常老年人及AD患者脑不同区域SOM阳性
神经元数量比较
| Control
(n=7) |
AD
(n=4) |
|
| frontal cortex(额叶) | 10.4±1.5 | 10.2±1.5 |
| hippocampus(海马) | 9.5±1.8 | 9.3±1.8 |
| occipital cortex(枕叶) | 7.8±2.0 | 7.5±1.7 |
Fig. 1 The arrow shows SOM positive neurons in the frantal cortex of AD patient. The neurons were labeled with immunohistochemistry and DAB methods(×200)
1 AD患者额叶皮层内SOM的免疫组化染色，用DAB显色法，箭头所示为SOM阳性神经元(×200)
Fig. 2 The arrow shows the apoptosis cell in frontal cortex of AD patient. The apoptosis cell were observed by TUNEL and DAB methods(×1000)
2 AD患者额叶皮层内，用TUNEL方法观察细胞凋亡，DAB显色法，
箭头所示为TUNEL阳性细胞(×1000)
3 讨论
本组标本均采用石蜡切片进行免疫组化染色，分别选用DBA和免疫荧光两种显色方法，均得到了较好的结果，Roberts［3］曾报告用石蜡切片进行SOM免疫组化染色，也得到了较满意的结果，进一步表明我们的结果是可靠的。本研究结果表明，不论是正常老年人还是AD患者，在不同部位大脑皮层中，均可见到SOM阳性神经元，这些SOM阳性神经元主要分布在海马锥体细胞的深层和额叶、枕叶的Ⅲ-Ⅳ层。这一结果与Ong和Garey(1991)［4］报道的结果大致相似。但我们观察到，上述SOM阳性细胞在正常老年人和AD患者脑内均较少，两组之间在数量上似无明显差别，这可能意味着SOM神经元的减少并非是AD发展过程中的一个特异性现象，在正常衰老过程中也可见到。Beal(1990)［5］和Dournaud等(1994)［6］认为SOM神经元可能在衰老过程中丢失，我们的结果支持这一观点。但是，因本组AD病例较少，结论尚有待样本的积累和进一步证实。
SOM阳性神经元与细胞凋亡的关系，目前尚未见报道。多数学者认为，脑内神经细胞凋亡系由于神经营养因子的缺乏和(或)某些异常物质的毒性作用所致。我们曾观察到TUNEL阳性细胞中仅13%为星形胶质细胞，其余则包括神经元和少突胶质细胞［7］，本研究发现大脑额叶、枕叶及海马皮层内的SOM阳性神经元，仅少数同时可见到细胞凋亡现象(即TUNEL阳性细胞与SOM阳性细胞重叠)，多数情况下两者并不平行重叠出现。提示细胞凋亡尽管存在于AD的病程中，但它不是造成SOM细胞减少的主要和唯一方式。
参考文献
1 Leake A, Perry EK, Perry PH, et al. Neocortical concentrations of neuropetides in senile dementia of the Alzheimer and Lewy body type:comparison with Parkinson’s disease and severity correlations. Biol Psychiatry, 1991, 29(4):357
2 Mazurek MF, Beal MF. Cholecystokinin and somatostatin in Alzheimer's disease postmortem cerebral cortex. Neurology, 1991, 41(5):716
3 Roberts GW, Crow TJ, Polak, JM. Location of neuronal tangles in somatostatin neurons in Alzheimer disease. Nature, 1985, 314(6006):92
4 Ong WY, Garey LJ. Distribution of GABA and neuropeptides in the human cerebral cortex. A light and electron microscopic study. Anat Embryol, 1991, 183(4):397
5 Beal MF. Somatostatin in neurodegenerative illnesses. Metabolism, 1990,39(9 Suppl 2):116
6 Dournaud P, Cervera-Pierot P, Hirsch E, et al. Somatostatin messenger RNA-containning neurons in Alzheimer disease:an in situ hybridization study in hippocampus, parahippocampal cortex and frontal cortex. Neuroscience, 1994, 61(4):755
7 李卫平，刘晓加，林宏川，等.老年期痴呆患者脑内细胞凋亡现象的研究.中华神经科杂志，1996，29(6)：340
(1998-04-08收稿)
（编辑：邱老）
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