阿尔茨海默病患者脑中双螺旋丝的体外去磷酸化作用
阿尔茨海默病患者脑中双螺旋丝的体外去磷酸化作用
中华神经科杂志 1998年第3期第31卷 *论著*
作者：王建枝 龚成新 I. Grundke-Iqbal K.Iqbal
单位： 430030 武汉，同济医科大学病理生理教研室(王建枝)；美国纽约州立基础研究化学病理实验室(龚成新、I.Grundke-Iqbal、K.Igbal)
关键词： 阿尔茨海默病；双螺旋丝；异常磷酸化；蛋白磷酸酯酶；去磷酸化作用
【摘要】 目的 探讨阿尔茨海默病(AD)脑损伤逆转的可能性及其途径。方法 用去磷酸化和免疫印迹法研究AD脑损伤可逆性。结果 蛋白磷酸酯酶(PP)-2A和PP-2B可使AD神经原纤维缠结中的II型双螺旋丝（PHFII-tau）在Ser-199/Ser-202去磷酸化，Ser-396/Ser-404部分去磷酸化;此外，PP-2A和PP-2B可分别使PHFII-tau的Ser-46和Ser-235去磷酸化;去磷酸化后PHFII-tau的相对电泳迁移率加快。Mn2 和Mg2 可增加上述酶对PHFII-tau的去磷酸化作用。酶的去磷酸化作用具有浓度依赖性，随着酶浓度的增加，去磷酸化作用增强。结论 因为tau蛋白异常过度磷酸化并形成PHF被认为是AD神经原纤维退化的基础，PHF可在体外被蛋白磷酸酯酶去磷酸化的结果提示，AD脑损伤可能是可逆的。
dephosphorylation of neurofibrillary tangles in Alzheimer brain Wang Jianzhi, Gong Chengxin, I.Grundke-Iqbal, et al. * Pathophysiology Department, Tongji Medical University, Wuhan 430030
【Abstract】 Objective To explore the pssibility and the way to reverse Alzheimer neurofibrillary degeneration. Methods the methods of dephosphorylation and Western blot were utilized. Results Protein phosphatases-2A and -2B dephosphorylated tau in type II paired helical filament (PHFII-tau) at ser-199/ser-202, partially dephosphorylated it at ser-396/ser-404. In addition, PP-2A and PP-2B dephosphorylated PHIFII-tau at ser-46 and ser-235, respectively. Dephosphorylation increased the relative electrophoretic mobility of tau. The divalent cations, Mn2 and Mg2 , stimulated the phosphatase activity in dephosphorylating of pHFII-tau. This activity further increased with the increasing of phosphatase concentration. Conclusion The data indicated that tau in the Alzheimer neurofibrillary tangles was still able to be dephosphorylated in vitro by protein phosphatases. Since the abnormal phosphorylation of tau was considered to be the primary lesion in Alzheimer neurofibrillary degeneration, it was postulated that this pathological lesion was reversible in vitro.
【Key words】 Alzheimer disease Paired helical filaments Abnormal phosphorylation Protein phosphatase Dephosphorylation
阿尔茨海默(AD)脑中有三种tau蛋白：(1)易溶型非异常磷酸化的tau(C-tau)；(2)易溶型异常磷酸化的tau(AD p-tau)；(3)以双螺旋丝聚集的tau(PHF-tau)。根据PHF-tau在2%十二烷基硫酸钠(SDS)中的溶解性，又可将其分为PHFI-tau和PHFII-tau［1］。与AD p-tau和PHFI-tau不同，PHFII-tau还被部分泛素化修饰［2］。
根据Cohen［3］的分类法，大量存在于人脑中的磷酸丝氨酰和磷酸苏氨酰蛋白磷酸酯酶主要包括四种类型:PP-1，PP-2A，PP-2B和PP-2C。从过去的研究中发现，PP-2C不使所研究的AD p-tau任何位点发生去磷酸化作用，而PP-1仅对少数位点起反应［4］。推测PP-2A和PP-2B可能在AD脑中tau异常磷酸化过程中起关键作用，所以二者均被选用于本研究。
对象和方法
一、组织和抗体来源
该研究中的AD及年龄、性别匹配对照者的脑组织来源于死后6小时内的尸体解剖(各取6例混合后制备匀浆)，AD确诊基于尸检组织切片的病理学检查，人脑组织均贮于-75℃直至使用。牛脑PP-2A和PP-2B的分离纯化分别参照Cohen等［5］和Sharma等［6］的方法。多克隆抗体92e和102C由Iqbal小组制备。单克隆抗体tau-1和PHF-1分别由Binder和Greenberg提供。单克隆抗体SMI-31，SMI-33和SMI-34从Sternberg单克隆公司购买。碱性磷酸酶标记的抗鼠和抗兔IgG从Sigma公司购买。
二、tau蛋白样品的制备
PHFII-tau蛋白制备参照Iqbal等［7］的长程序从AD患者脑中制备。其简要步骤如下:将AD大脑皮质去脑膜及白质后制备匀浆，再用不同孔径尼龙膜进行筛分，在2% SDS溶液中加热和超声破碎，不连续蔗糖密度梯度离心和玻璃珠层析。AD P-tau的制备参阅Kopke等［1］法。
三、去磷酸化反应
除特别标明外，去磷酸化反应均在37℃进行45分钟。反应混合液中含50 mmol/L Tris-HCl (pH 7.0)，20 mmol/L β-巯基乙醇，0.1 g/L牛血清白蛋白，1.0 mmol/L MnCl2;各0.01g /L 抑肽酶(aprotinin)，Leupeptin 和胃酶抑素(pepstatin)， 0.07 g/L PHF-Ⅱ-tau，2 U/ml PP-2A或5 U/ml PP-2B(1单位PP-2A或PP-2B分别指在30℃，每分钟催化磷酸化酶a或磷酸化酶激酶释放1.0 nmol磷酸的酶量)。在用PP-2B进行的去磷酸化反应液中，还含有1 mmol/L CaCl2和1 μmol/L钙调素。AD P-tau的去磷酸化反应条件除用较低的磷酸酶浓度外［8，9］，其余同PHFII-tau的去磷酸化条件。去磷酸化位点的检测用免疫印迹法。
四、免疫印迹法
经去磷酸化处理的样品先用4倍体积预冷丙酮进行沉淀，再溶于SDS-PAGE(聚丙烯酰胺凝胶电泳)样品缓冲液，煮沸5分钟后进行5%～15% SDS-PAGE。所用一级抗体的稀释倍数及特性见附表。印迹样品用碱性磷酸酶标记的抗鼠或抗兔IgG作为第二抗体，以5-溴-4-氯-3吲哚磷酸-对氨基甲苯盐(BCIP)和对硝基蓝四唑氯(NBT)作为底物进行显色分析。
结果
一、PP-2A和PP-2B可在多部位使PHFII-tau去磷酸化
PP-2A(2U/ml)和PP-2B(5U/ml)可使PHFII-tau的tau-1表位显色，PP-2A和PP-2B还分别使PHFII-tau的Ser-46和Ser-235去磷酸化。两种酶均使
附表 几种抗tau抗体的性质
| 抗体 | 稀释 | 类型a | 特异性b | 识别位点c |
| 102C | 1∶100 | P | NP | Ser-46 |
| tau-1 | 1∶50 000 | M | NP | Ser-199/Ser-202 |
| SMI33 | 1∶500 | M | NP | Ser-235 |
| SMI31 | 1∶50 | M | P | Ser-396/Ser-404 |
| SMI34 | 1∶50 | M | P | Ser-235/Ser-396d |
| PHF-1 | 1∶100 | M | P | Ser-396 |
| 92e | 1∶5 000 | P | NP P | tau |
a：P为多克隆抗体，M为单克隆抗体；b：NP为非磷酸化，P为磷酸化；c：根据人类tau441编号；d:可能的识别位点，SMI33为构象依赖性抗体
SMI31和SMI34表位显色减退。用单克隆抗体PHF-1检测到的PHFII-tau Ser-396/Ser-404位的去磷酸作用比用单克隆抗体SMI31所检测到的作用弱;多克隆抗tau抗体92e显示去磷酸化作用使PHFII-tau的电泳迁移率加快。
二、 PHFII-tau的去磷酸作用比AD P-tau需要更高浓度的PP-2A和PP-2B
以1 U/ml的PP-2B不能使PHFII-tau蛋白的tau-1表位显色，同样条件下，0.5 U/ml的PP-2A仅产生微弱的显色反应;PHFII-tau的tau-1表位最强的显色反应在PP-2A所需的酶浓度为2 U/ml，在PP-2B为5U/ml。与此相比，虽然随着酶浓度升高，显色反应加强，0.1 U/ml PP-2A和0.36 U/ml PP-2B便可使AD P-tau去磷酸化。实验中没有检测到PHFII-tau样品对上述磷酸酯酶的抑制作用(资料未显示)。
三、 磷酸酯酶对PHFII-tau的去磷酸化作用受多种效应剂影响
Mn2 激活PP-2A和PP-2B对PHFII-tau的去磷酸化作用，两种酶活性均随Mn2 浓度增加而增高，在0.1 mmol/L时达最大显色反应。Mg2 在1.0 mmol/L浓度时对两酶均有激活作用，但0.1 mmol/L时无作用。Ca2 和钙调素激活PP-2B，然而，如果在反应液中同时加入Mg2 或Mn2 ，其活性进一步增高。PP-2A的活性几乎不受多聚赖氨酸影响。
讨论
AD最为特征性的脑病理改变之一是受累神经元中PHF神经原纤维缠结的形成。微管相关蛋白tau的异常磷酸化可能加速了tau向PHF的聚集过程。过去的研究已经证明：形成PHF结构以前的易溶型异常磷酸化tau蛋白，即AD P-tau的多个异常磷酸化位点可被PP-2A和PP-2B去磷酸化［8］。在本研究中，我们进一步探讨了PHF/NFT结构中的tau蛋白的体外去磷酸化作用。结果证明:PP-2A和PP-2B均可不同程度地、位点特异性地使PHF/NFT去磷酸化。且这种去磷酸化作用随酶浓度增加而增强，这一研究结果为AD治疗途径探索提供了理论依据。
Mn2 和Mg2 分别以0.01 mmol/L和1.0 mmol/L浓度时刺激PP-2A和PP-2B的活性，这些是Mn2和Mg2 的生理状态的浓度范围。所以，这些金属离子对酶的激活可能具有生理性以及治疗意义。
与AD P-tau相比，PHFII-tau的去磷酸化需要更高的酶浓度。对AD P-tau，0.1 U/ml PP-2A或0.36 U/ml PP-2B便可使其tau-1表位去磷酸化，而PHFII-tau相同位点同等程度去磷酸化需2U/ml PP-2A或5U/ml PP-2B。从病理学上，AD P-tau和PHFII-tau可能分别反映AD神经原纤维退化的早期和晚期病变过程。从生化角度分析，在PHF中的tau蛋白的结构状态可能不利于上述磷酸酯酶的作用，如异常磷酸化tau蛋白的羧基末端在聚集成PHF过程中被埋入分子里，因此，不能与磷酸酯酶接触。这也可能解释了为什么AD P-tau中Ser-396/Ser-404很容易被PP-2A和PP-2B去磷酸化［10，11］，而PHFII-tau中的上述位点仅被部分去磷酸化，其确切机制尚待进一步研究探讨。
使用AD P-tau作底物，大鼠脑中制备的PP-2A或PP-2B作酶源，Gong等［10，11］曾经报道:PP-2B的去磷酸化活性比PP-2A强。然而，本研究发现:牛脑中分离纯化的PP-2A对PHFII-tau的去磷酸化活性高于PP-2B。这些结果提示，PP-2A和PP-2B在AD-tau蛋白的异常磷酸化中可能都起作用。研究结果的差异可能与底物及酶源差异有关。
参考文献
1 Kopke E, Tung YC, Shaikh S, et al. Microtubule-associated protein tau: abnormal phosphorylation of a non-paired helical filament pool in Alzheimer disease. J Bilo Chem, 1993, 268:24374-24384.
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3 Cohen P. The structure and regulation of protein phosphorylation. Annu Rev Biochem, 1989, 58:453-508.
4 Gong CX, Grundke-Iqbal I, Damuni Z, et al. Dephosphorylation of microtubule-associated protein tau by protein phosphatase-1, and -2C and its implication in Alzheimer disease. FEBS Lett, 1994, 341:94-98.
5 Cohen P, Alemany S, Hemmings BA, et al. Protein phosphatase-1 and protein phosphatase-2A from rabbit skeletal muscle. Methods Enzymol, 1988, 159:390-408.
6 Sharma RK, Taylor WA, Wang JH. Use of calmodulin affinitychromatography for purification of specific calmodulin dependent enzymes. Methods Enzymol, 1983, 102:210-219.
7 Iqbal K, Zaidi T, Thompson CH, et al. Alzheimer paired helical filaments: bulk isolation, solubility and protein composition. Acta Neuropathol (Berl), 1984, 62:167-177.
8 Wang JZ, Grundke-Iqbal I, Iqbal K. Restoration of biological activity of Alzheimer abnormally phosphorylated tau by dephosphorylation with protein phosphatase-2A, -2B and -1. Mol Brain Res, 1996,38:200-208.
9 Wang JZ, Gong CX, Zaidi T, et al. Dephosphorylation of Alzheimer paired helical filaments by protein phosphatase-2A and -2B. J Biol Chem, 1995, 270:4854-4860.
10 Gong CX, Singh T, Grundke-Iqbal I, et al. Protein phosphatase activity in Alzheimer disease brain. J Neurochem, 1993, 61:921-927.
11 Gong CX, Grundke-Iqbal I, Iqbal K, et al. Dephosphorylation of Alzheimer disease abnormally phosphorylated tau by protein phosphatase-2A. Neurosci, 1994, 61:765-772.
(收稿：1997-12-24 修回：1998-02-26)
（编辑：邱老）
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