阿尔茨海默病与线粒体DNA变化的氧应激

阿尔茨海默病与线粒体DNA变化的氧应激

中华神经科杂志 2000年第1期第33卷 综述

作者：邱小忠　 陈瑗　 周玫

单位：邱小忠（广州, 第一军医大学分子生物学研究所自由基医学研究室510515 ）；陈瑗（广州, 第一军医大学分子生物学研究所自由基医学研究室510515 ）；　周玫（广州, 第一军医大学分子生物学研究所自由基医学研究室510515 ）

　　阿尔茨海默病（AD）的研究已成为医学研究的一个热点，各国学者从不同角度对AD进行了多方位的研究，然而，引起AD的最终机制仍还在探索之中^［1-3］。线粒体内的氧化磷酸化过程是体内氧自由基的主要来源，自由基在AD发生中的作用，已日益受到关注；近几年来，AD与线粒体脱氧核糖核酸（mtDNA）氧应激关系的研究，成为探讨AD发病机理的新动向^［1］。

　　一、β-淀粉样沉积蛋白（β-amyloid，Aβ）与氧应激

　　AD的自由基损伤的事实包括AD病人中出现了较高的蛋白质氧化作用和脂质过氧化作用，并且Cu/Zn-SOD(超氧化物歧化酶)及Mn-SOD活性减少^［2-8］。Covell 等^［3］观察到AD脑中出现一种氧化蛋白标志物（蛋白羰基结构）的增高以及谷氨酰胺合成酶的氧化敏感性降低的现象,脑中氧的消耗大，抗氧化酶相对较少，这说明氧应激是AD形成的一个重要因素。

　　现在已知AD中的突变都直接和长片段的Aβ累积有关，Aβ是来自amyloid前体蛋白（APP）的由39～43个氨基酸组成的多肽，正常情况下APP从Aβ段中裂解以阻止Aβ的产生，导致家族性AD突变的途径主要是由β-secretase 及γ-secretase 两种断裂酶来完成^［4］。大约50％的早发性AD与早老素基因（PS-1基因）的各种不同突变有关，PS-1基因突变通过APP的改变或细胞凋亡途径导致神经元细胞退行性病变，AD中APP的改变过程包括作为神经毒Aβ产量的提高和APP在α-secretase作用下的神经保护性片段（sAPPα）减少^［5］。Aβ与AGE受体（RAGE）相互作用，能增加体内H₂O₂的累积，产生氧化伤害，引起细胞凋亡，AD中氧应激引起小胶质细胞顺Aβ浓度梯度迁移，导致老年斑周围出现小胶质细胞聚集^［6］。Aβ还能增加脂质过氧化，H₂O₂和Aβ一样都能增加NF-κB蛋白的失常表达，从而引起细胞的凋亡反应，Aβ导致的早发性AD事件出现类似自由基作用的细胞膜损伤现象，利用VitE等抗氧化剂和自由基清除剂能解除Aβ的毒性^［2］，抗Aβ毒性的细胞表现出较强的抗H₂O₂毒性^［7-9］。Bozner等^［10］利用50 μm Aβ（25～35）片段诱导了 PC 12 细胞线粒体DNA (mtDNA)的氧应激损伤，并通过Southern杂交技术检测了mtDNA的氧化损伤，用mtDNA专门的探针识别了13.3 kb的缺失片段。Swerdlow等^［11］将AD病人的线粒体转入Ntera2/D1 (NT2) 细胞中，形成的cybrids细胞出现活性氧的产量的提高，抗氧化酶的活性有明显提高，这表明AD 病人中mtDNA中编码细胞色素氧化酶VI的基因突变足够引起包括氧自由基的生化损伤。

　　二、 AD线粒体损伤与氧应激

　　AD线粒体受到损伤能产生氧应激。将AD病人及正常人的线粒体分别注入mtDNA的人SH-SY5Y细胞（P0细胞）形成转线粒体细胞(cybrids),结果和对照组的cybrids细胞相比，AD cybrids 细胞中电子传递链(ETC) 复合物IV的活性减少52%^［12］。AD cybrids细胞中活性氧（ROS）的量也有提高，复合物IV是由线粒体DNA所编码的，这表明线粒体及mtDNA损伤与AD有关，AD中线粒体复合物IV活性的降低，直接与活性氧的产生有关，将线粒体电子传递链复合物IV的活性进行抑制，结果含有正常人线粒体的SH-SY5YS细胞株中的活性氧（ROS）水平提高^［11,12］。利用铁和H₂O₂也能诱导β-淀粉样沉积的产生，在正常的发育过程中活性氧对线粒体DNA的损伤明显与年龄有关，老年鼠中mtDNA 的损伤远远超过幼鼠中mtDNA的损伤^［7,8,13］。线粒体功能紊乱改变了淀粉样蛋白的代谢过程，使得AD患者脑中出现了淀粉样变性，AD线粒体损伤导致了氧应激加剧。

　　另外，AD中的氧应激可导致线粒体损伤。除小脑外，AD病人大脑中的线粒体膜流动性明显减少，而在对照组中，线粒体膜的流动性随着年龄的增加而逐步减少。当线粒体暴露在FeCl₂和H₂O₂中时，其膜的流动性急剧下降，线粒体DNA中被氧化的8-hydroxy-2′-deoxyguanosine (OH8dG) 的量也大大提高，这表明在AD的形成过程中，氧应激起着非常重要的作用。 自由基的产生和消除的速率维持着一种动态平衡，氧应激的产生过程是这种平衡被打破的过程，这种平衡的破坏由酸中毒、过渡金属及Aβ肽段等因素诱发^［14］。活性氧（如*OH）大多能促使蛋白过氧化、脂质过氧化及核酸过氧化，在线粒体有氧呼吸过程中产生的超氧阴离子，进一步形成羟自由基（*OH）等活性氧，引起线粒体损伤；存在NO时，超氧阴离子将转变为过氧亚硝酸等活性氧^［15,16］。Keller等^［17］发现Mn-SOD过度表达能抑制Fe² 和Aβ诱导的细胞凋亡，Mn-SOD过度表达的细胞中，谷胱甘肽过氧化物酶的活性提高，增加了对自由基的清除作用，说明Aβ、超氧阴离子和过氧亚硝酸导致的线粒体功能受损，在神经细胞损伤中起重要作用。位于染色体14上的早老素基因1（PS1）编码受体蛋白和通道蛋白，其基因突变能增加Tau蛋白磷酸化，增加Aβ的形成；Aβ诱导的转录因子NF-κB活性的阻断和钙离子浓度升高同线粒体功能缺损有关，Aβ诱导的线粒体功能缺损包括线粒体膜的去极化、氧消耗减少和组成线粒体电子传递链的复合物I、II、III的功能阻断^［5,13］；Aβ能引起线粒体活性氧的产生，诱导早老性AD的发生^{［7-9，13］}。

　　总之，AD中线粒体的损伤与氧应激是密切相关的，AD中的线粒体受到损害能产生氧应激，而氧应激又加剧线粒体的损害作用， AD正是这两种因素相互作用的结果。

　　三、 AD中线粒体氧应激的分子基础

　　1988年，首次证实mtDNA的错义突变与人类遗传病有关后，mtDNA突变与进行性退变关系的研究越来越引起人们的兴趣,AD的线粒体学说已受到广泛的关注^［1］。基于AD病人组织中氧化磷酸化酶系（OXPHOS）及ATP 合成酶的活性改变，mtDNA的损伤可能是AD病人脑损伤的重要原因。线粒体DNA是由16 596 bp组成的裸露的双链环状分子，它编码OXPHOS中的5个复合物中的4个复合物；mtDNA缺少组蛋白的保护作用，易受活性氧种（ROS）的侵害，正常细胞大约有 1％～5％的氧会逃离正常的细胞色素氧化酶催化过程产生ROS，由于自由基半衰期短，就近裸露的mtDNA就成为容易攻击的对象^［1,9,16］。ROS诱导的mtDNA包括单链及双链的断裂、碱基缺失及突变，Hamblet等^［18］利用PCR及 Southern技术发现AD病人的mtDNA缺失5 kb的机率比对照组大6.5倍，表明AD病人中mtDNA的损伤积累比一般人更为严重。相对于核DNA来说，线粒体产生更多的象8-Oxoguanine的损伤性碱基^［19,20］；线粒体DNA编码的细胞色素氧化酶的亚基I、亚基II和亚基III的mRNA 有50% 的减少；然而，AD与mtDNA突变的关系一直未能很好的阐明。

　　1997年，美国两个独立的研究小组分别对AD 患者的mtDNA进行了研究，Davis 等^［21］首先根据人体mtDNA的Cambridge序列，扩增了编码细胞色素氧化酶亚基I（COI）、亚基II（COII）和亚基III（COIII）的mtDNA片段，通过序列测定和引物延伸法等各种手段，发现了CO1和CO2基因各有3个错义突变，CO1基因的变化：6 366位/G→A，导致编码的Val突变为Ile；6 483位/C→T的无义突变；7 146位/A→G,导致编码的Thr突变为Ala。CO2基因的变化：7 650位/C→T,导致编码的Thr突变为Ile；7 868位/C→T,导致编码的Leu突变为Phe；8 025位/A→G,导致编码的Ile突变为Val。并认为这些错义突变在正常人群中的发生率很低，而在AD患者中则频率较高。Fahy等^［22］采用近乎相似的方法，同时研究了AD病人血液中血小板及白细胞的mtDNA变化，得到与了与Davis一致的结果，并认为mtDNA中编码细胞色素氧化酶的基因出现错义突变，导致了电子传递链的功能紊乱，可能与AD病人脑中出现的几个病理性特征密切相关。

　　一种疾病（如AD）有关的两个基因同时出现几个碱基的错义突变，在以前是很少发现的。1997年，美国学者Wallace等^［1］采用和Davis 等相同的mtDNA的扩增引物，将缺失了mtDNA的WALZA 和143B-TK＋细胞株（P0细胞）进行PCR扩增，结果发现缺失mtDNA的P0细胞也扩增出了CO1和CO2片段，并通过酶切分析后，发现从核DNA扩增出的CO1和CO2片段，同样分别存在Davis等提出的3个错义突变；进一步的序列分析发现CO1和CO2基因除了这6个错义突变外，另外还有32个错义突变，这一惊人的发现使得Wallace提出人的核基因中存在和mtDNA相似的假基因，并认为Davis所扩增出的CO1和CO2片段其实是核DNA上存在的类似的假基因片段。基于这一现象已在动物中发现，Wallace等^［1］通过序列分析比较了人体细胞和其他动物细胞中CO1和CO2的假基因的系统关系，发现人类中核CO1和CO2和人的线粒体CO1和CO2的亲缘关系最近，其他学者也证明核CO1和CO2假基因是一种古老基因^［23］。

　　然而，AD中确实存在线粒体mtDNA发生错义突变的现象，组成氧化磷酸化体系各种组分的活性有所下降，特别是组成复合物IV的细胞色素氧化酶的亚基I和亚基II的活性改变，自然与编码该蛋白的mtRNA的损伤有关。Tanno等^［24］对 92 例日本AD病人和59例正常对照组进行了mtDNA的多态性研究，结果表明：在编码 12S rRNA的mtDNA有两个新的突变, 90例病人中有1例的第856位（nt 856）有3个胞嘧啶的插入，90例病人中有2例的第856位（nt 856）的A突变为G，而在对照组中都没有出现突变。Aβ的累积增加能导致线粒体的能量产生出现缺陷，增加线粒体内的活性氧水平，而mtDNA对此非常敏感，Hutchin等^［25］发现了mtDNA5 705位/G→C的突变和AD有关。Egensperger等^［26］的研究表明，AD及PD病人的线粒体中编码tRNA(Gln)的mt DNA序列都存在4 336位的A突变成G 的现象，在欧洲体人的线粒体谱系中，大约5％的AD患者的mtDNA的4 336位有突变，而在正常人中只有0.7％的突变频率。

　　四、 展望

　　线粒体DNA处在氧自由基最频繁的部位，所遭受的自由基侵害的机会很多，许多研究表明AD病人中电子传递链各组成成分的活性下降和mtDNA的损伤有关，mtDNA受到损害的机会比核DNA更为广泛和持久。氧化磷酸化系统是由mtDNA和核DNA共同编码的，它们存在一些相似的转录调节因子，AD病人内编码氧化磷酸化有关酶的线粒体和核基因的表达都有减少。核内调节氧化磷酸化系统的核转录因子1（NRF-1）和核转录因子2（NRF-2）能调控编码氧化磷酸化复合物IV的表达，而改变线粒体的功能;此外,mtDNA的转录也有一些线粒体的转录因子调控（mtTFA），NRF-1和NRF-2在体外能与mtTFA的启动子结合，表明编码氧化磷酸化系统的mtDNA和核存在一些相似的转录调节因子，也许转录因子的氧应激损害，引起核和线粒体的OXPHOS有关基因的调节失控，导致了AD的产生，更为确凿的证据有待有进一步研究^［20］。

　　参考文献：

　　［1］Wallace DC， Stugard C， Murdock D， et al. Ancient mtDNA sequences in the human nuclear genome: a potential source of errors in identifying pathogenic mutations.Proc Natl Acad Sci USA，1997， 94: 14900-14905.

　　［2］Behl C， Davis JB，Lessley R， et al. Hydrogen peroxide mediates amyloid β protein toxity. Cell， 1994, 77:817-827.

　　［3］Lovell MA，Ehmann WL， Butler SM，et al. Elevated thiobarbituric acid-reactive substances and antioxidant enzyme activity in the brain in Alzheimer disease. Neurology ，1995， 45: 1594-1601.

　　［4］Hardy J. Amyloid,the presenilins and Alzheimer′s disease. Trand Neurosci, 1997，20:154-159.

　　［5］Guo Q, Robinson N, Mattson MP. Secreted beta-amyloid precursor protein counteracts the proapoptotic action of mutant presenilin-1 by activation of NF-kappaB and stabilization of calcium homeostasis. J Biol Chem, 1998, 273: 12341-12351.

　　［6］Shi Du Yan, Xi Chen,Jin Fu,et al. RAGE and Amyloid-β peptide neurotoxicity in Alzheimer′s disease. Nature,1996, 382:685-691.

　　［7］Mattson MP, Robinson N, Guo Q. Estrogens stabilize mitochondrial function and protect neural cells against the pro-apoptotic action of mutant presenilin-1.Neuroreport, 1997, 8:3817-3821.

　　［8］Preston JE,Hipkiss AR, Himsworth DT, et al. Toxic effects of beta-amyloid(25-35) on immortalised rat brain endothelial cell: protection by camosine, homocamosine and beta- alanine. Neurosci Lett, 1998,242:105-108.

　　［9］Keller BA, Begley JG, Fu W, et al. Bcl-2 protects isolated plasma and mitochondrial membrances against lipid peroxidation induced by hydrogen peroxide and amyloid beta-peptide. J Neurochem, 1998,70: 31-39.

　　［10］Bozner P, Grishko V, LeDoux SP,et al. The amyloid beta protein induces oxidative damage of mitochondrial DNA. J Neuropathol Exp Neurol, 1997, 56: 1356-1362.

　　［11］Swerdlow RH, Parks JK, Cassarino DS,et al. Cybrids in Alzheimer′s disease: a cellular model of the disease? ［see comments］. Neurology, 1997,49: 918-925.

　　［12］Sheehan JP, Swerdlow RH, Miller SW,et al. Calcium homeostasis and reactive oxygen species production in cells transformed by mitochondria from individuals with sporadic Alzheimer′s disease.J Neurosci, 1997, 17: 4612-4622.

　　［13］Guo Q, Fu W, Xie J, et al. Par-4 is a mediator of neuronal degeneration associated with the pathogenesis of Alzheimer disease ［see comments］. Nat Med, 1998, 4: 957-962.

　　［14］Mecocci P, Beal MF, Cecchetti R,et al. Mitochondrial membrane fluidity and oxidative damage to mitochondrial DNA in aged and AD human brain. Mol Chem Neuropathol, 1997, 31: 53- 64.

　　［15］Wilson JX. Antioxidant defense of the brain: a role for astrocytes. Can J Physiol Pharmacol, 1997,75: 1149-1163.

　　［16］Mattson MP. Mother′s legacy: mitochondrial DNA mutations and Alzheimer′s disease. Trends Neurosci, 1997, 20:373-375.

　　［17］Keller JN, Kindy MS,Holtsberg FW, et al. Mitochondrial manganese superoxide dismutase prevents neural apoptosis and reduces ischemic brain injury: suppression of peroxynitrite production,lipid peroxidation , and mitochondrial dysfunction. J Neurosci, 1998, 18:687-697.

　　［18］Hamblet NS, Castora FJ. Elevated levels of the Kearns-Sayre syndrome mitochondrial DNA deletion in temporal cortex of Alzheimer′s patients. Mutat Res, 1997,379: 253-262.

　　［19］Chandrase KK, Giordano T, Brady DR, et al. Rapoport- SIImpairment in mitochondrial cytochrome oxidase gene expression in Alzheimer disease. Brain Res Mol Brain Res, 1994,24: 336-340.

　　［20］Chandrase KK, Hatanpaa K, Rapoport SI, et al. Decreased expression of nuclear and mitochondrial DNA-encoded genes of oxidative phosphorylation in association neocortex in Alzheimer disease. Brain Res Mol Brain Res， 1997, 44: 99-104.

　　［21］Davis RE, Miller S, Herrnstadt C, et al. Mutations in mitochondrial cytochrome c oxidase genes segregate with late-onset Alzheimer disease. Proc Natl Acad Sci USA, 1997, 94:4526-4531.

　　［22］Fahy E, Nazarbaghi R, Zomorrodi M, et al. Multiplex fluorescence-based primer extension method for quantitative mutation analysis of mitochondrial DNA and its diagnostic application for Alzheimer′s disease.Nucleic Acids Res, 1997, 25: 3102-3109.

　　［23］Davis JN, Parker WD. Evidence that two reports of mtDNA cytochrome c oxidase “mutations” in Alzheimer′s disease are based on nDNA pseudogenes of recent evolutionary origin.Biochem Biophys Res Commun, 1998, 244: 877-883.

　　［24］Tanno Y,Okuizumi K, Tsuji S. mtDNA polymorphisms in Japanese sporadic Alzheimer′s disease. Neurobiol Aging, 1998, 19 Suppl 1: S47-51.

　　［25］Hutchin TP, Heath PR, Pearson RC, et al. Mitochondrial DNA mutations in Alzheimer′s disease. Biochem Biophys Res Commun,1997,241: 221-225.

　　［26］Egensperger R, Kosel S, Schnopp NM,et al. Association of the mitochondrial tRNA(A4336G) mutation with Alzheimer′s and Parkinson′s diseases. Neuropathol Appl Neurobiol, 1997, 23: 315-321.

收稿日期：1999-02-26

（编辑：邱老）

(免 责声明：本站文章和信息来源于互联网，系网络转载，转载出于传递更多信息和学习之目的，并不 代表 本网赞同其观点或证实其内容的真实性。如转载文章涉及作品内容、版权等问题，请立 即与本网站联系，我们将在第一时间删除内容!)